本文以雜質或組分相對復雜的抗感染藥物為例，重點介紹了中檢院通過研制特定雜質對照品和混合雜質對照品，嘗試解決上述問題的思路，提出雜質對照品的研發(fā)策略，并闡述目前存在的問題和今后的發(fā)展方向。

雜質譜；標準物質；雜質對照品；抗感染藥物；藥品標準

藥物雜質因其可能對藥品安全性、有效性和質量產生影響，目前已成為國內外藥品監(jiān)管機構重點關注的內容之一。人用藥品注冊技術要求國際協調會(ICH)頒布了多項針對雜質的研究指導原則，如原料藥、制劑雜質研究指導原則(ICH Q3A、ICHQ3B)、殘留溶劑研究指導原則(ICH Q3C)、元素雜質研究指導原則(ICH Q3D)等[1-4]。近年來在國內開展的仿制藥質量與療效一致性評價中，藥品審評中心也頒布了一系列評價技術指導原則/要求，其中雜質的研究是關注的重點。在藥品審評審批要求的推動下，加之化學分析檢驗檢測技術的不斷提升，近年來藥物雜質譜的研究得以蓬勃發(fā)展。

目前，中國藥典和國外通用藥典基本都采用高效液相色譜法(HPLC)檢測化學藥品中的有關物質。伴隨著藥品質量標準中對雜質控制力度的加大，對復雜體系樣本中雜質的分離分析成為雜質譜控制的關鍵技術問題之一[5]，如何快速有效地對雜質進行定位進而定量，成為亟待解決的熱點問題。此外，在標準執(zhí)行過程中，如何對方法進行評價、確認和轉移，也成為藥品質量控制的難點[6]。鑒于傳統的抗生素類藥品多來源于發(fā)酵或半合成，其組分、雜質組成復雜，純度相對較低，上述問題尤為突出。而采用適宜的雜質對照品則可以較為直接地解決上述難題[7-8]。為解決日益凸顯的雜質檢測、定位、控制以及復雜體系方法評價等問題，雜質對照品的研制成為近年來中檢院標準物質研制的重點，其主要圍繞著研制特定雜質對照品和混合雜質對照品兩個方向展開。本文重點介紹抗感染藥物雜質對照品的研制策略與方法。

1.1 單個特定雜質對照品

對于任一活性物質(API)，其雜質通常有多個來源，包括工藝雜質、降解雜質、原輔料混入的雜質等，在其系列雜質中，究竟著力于研究哪些特定雜質并建立對照品是這一工作的關鍵。對現行質量標準中尚未控制特定雜質的API，科學地研制特定雜質對照品，可以促進藥品質量標準的提升，提高藥品的內在質量。目前，特定抗感染藥物雜質對照品的研制主要考慮以下3個因素：①雜質是否具有明確的毒性反應或與臨床中特定副反應密切相關，如遺傳毒性雜質和β-內酰胺類抗生素中的聚合物雜質等；②雜質是否具有特定的毒性功能基團，并與母體化合物相比相對毒性反應明顯增大；③雜質是否可作為與工藝穩(wěn)定性密切相關的指針性雜質。此外，對擬進行研制的雜質對照品，還需具有來源清晰、結構明確、候選原料的合成工藝路線簡單、合成產物穩(wěn)定性良好等特點。基于上述原則，近年來，抗感染藥物標準物質研制了多個單獨或一系列具有質控價值的特定雜質對照品。

以頭孢唑林鈉品種為例，2-巰基-5-甲基-1,3,4-噻二唑(MMTD)是頭孢唑林鈉的3位側鏈，它不僅是頭孢唑林鈉合成時用到的中間體，也是其主要降解產物之一。在對頭孢唑林和雜質ADMET的預測與安全性評估中發(fā)現，頭孢唑林鈉的毒性作用主要與3-位側鏈的MMTD結構相關，MMTD的毒性作用較頭孢唑林的毒性強約10倍[9]?；谏鲜鎏攸c，在國內藥品質量標準尚未對MMTD進行控制時，中檢院2010年率先建立了MMTD定量測定用對照品。頭孢唑林鈉主要生產企業(yè)繼而使用該對照品，以MMTD為指針調整和優(yōu)化生產工藝，修訂內控質量標準，使頭孢唑林鈉出廠時的主要毒性雜質MMTD含量均低于0.1%。中國藥典2010年版開始控制頭孢唑林鈉中的雜質MMTD(雜質E，限度為1.0%)。2003年的國家藥品抽檢中，國產注射用頭孢唑林鈉中雜質E的含量為0.1%~0.6%，較2009年數據已經有所提高[10]；而2020年國家藥品抽檢結果顯示，在200余批國產注射用頭孢唑林鈉中雜質E基本均為未檢出(未發(fā)表資料)，提示該品種的質量得以較大幅度地提高。

藥物生產過程中使用的中間體及試劑等的殘留物也是藥品的雜質來源之一。針對毒性殘留物等，也需建立相應的特定雜質對照品對其加以控制。2-萘酚是頭孢拉定和頭孢氨芐等原料合成過程中常用的沉淀劑。2009年國家藥品抽檢中發(fā)現，213批頭孢氨芐制劑中有187批檢出了2-萘酚，殘留量多為0.01%~0.05%，殘留量在0.05%~0.1%的樣品約占12.7% ，而部分樣品中2-萘酚含量已超過0.1%；168批頭孢拉定膠囊樣品檢出了2-萘酚，占總批數的44.2%，最大含量為0.00684%；2-萘酚對皮膚、黏膜有強烈的刺激作用，易經皮膚吸收，對腎臟有強烈的刺激作用，對機體的免疫系統也有一定的抑制和損傷作用，還能通過胎盤屏障、血腦屏障[11]。藥品中殘留的2-萘酚進入人體存在嚴重的安全隱患?；诖?，中檢院開始研制2-萘酚定量測定用雜質對照品，并推動中國藥典2015年版在頭孢拉定和頭孢氨芐各論項下開始收載2-萘酚檢查，提高了上述品種的質控水平。

1.2 系列特定雜質對照品

為解決雜質對照品等以往都是在質量標準修訂后才開始研制的被動局面，按質量源于設計的理念，中檢院提出了抗感染藥物先于質量標準研制系列雜質對照品的理念，即按抗感染藥物的類別，合成同類不同品種的系列雜質對照品，如喹諾酮類和康唑類[12-13]等系列雜質對照品。這類特定雜質對照品可滿足仿制藥一致性評價和藥品注冊對API雜質譜研究的需求，同時也適用于藥品質量標準的提高。

系列特定雜質對照品的研制大多需經特殊合成和制備，其研制思路可概括為：首先結合API的結構、生產工藝、降解規(guī)律等特點，初步確定目標雜質的結構；再設計合成路線確定合成工藝；得到目標雜質后，按要求開展結構確證；并采用質量平衡法或其他可靠的方法賦值。此外，還應測定雜質的校正因子(響應因子)，為后續(xù)替代成本較高或穩(wěn)定性不理想的實物對照品做儲備。其主要研制流程見圖1。

按上述研制思路，目前我們對抗感染藥物中的喹諾酮類、康唑類[11-12]、磺胺類等共19個品種建立了70個系列雜質對照品(見表1)，如伊曲康唑系列雜質對照品，包括伊曲康唑A、B、C、D、E、F和G共7個雜質對照品，涉及伊曲康唑合成中的副產物、中間體以及降解雜質等。

此類雜質對照品的建立，為后續(xù)相關藥物的質量標準提高工作提供了堅實的基礎。如在進行加替沙星原料及制劑質量標準的提高時，借助所建立的5個雜質對照品，優(yōu)化了液相色譜條件，并選擇能夠有效表征色譜分離情況且易獲得的雜質對照品(N-甲基加替沙星、8-羥基加替沙星、8-氟加替沙星和加替沙星N-甲基物)進行系統適用性試驗，較原進口注冊標準采用2-甲基哌嗪加替沙星雜質對照品進行分離度考察更具有合理性和可行性。

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制備特定雜質對照品,往往需要耗費大量的人力?物力,且可能仍然無法滿意對諸多雜質對照品的需求?目前,各國藥典在HPLC有關物質檢測中,采用原位降解技術對特定雜質進行定位,或利用雜質與主成分的相對保留時間進行定位是常用的策略?但色譜峰的相對保留時間容易受到不同實驗室?不同色譜柱?不同品牌儀器以及實驗條件等差異的影響?采用原位降解的方式,通常降解制備過程較為繁瑣?產生雜質有限且重現性較差?如何有效地對多個雜質快速進行定位和歸屬,一直是藥品質控中亟待解決的熱點和難點問題[7-8]?利于混合雜質對照品進行系統適用性試驗,集對色譜系統有效性的評價/確認?雜質的定位于一體,已經越來越多地應用于解決復雜實驗體系有關物質分析中雜質的定位?方法的確認和轉移等問題?我們也在探討建立抗感染藥物混合雜質對照品的一般方法[14]?

針對不穩(wěn)定抗生素藥品的特點,我們提出了制備不穩(wěn)定API混合雜質對照品及其應用的思路,其研制流程見圖2?

應用時,利用混合雜質對照品進行系統適用性試驗,評價色譜系統對各雜質的分離情況;利用混合雜質對照品中提供的特定雜質的色譜保留信息和紫外光譜信息等可對樣品中的特定雜質進行定位?為加強混合雜質對照品的實用性,在混合雜質對照品的說明書中附標準色譜圖譜,并給出獲得該色譜圖時所采用的色譜柱,以便于使用實驗室之間進行比對?目前混合雜質對照品的研制主要針對不穩(wěn)定的β-內酰胺類抗生素?發(fā)酵和半合成來源的大環(huán)內酯類抗生素等?從中國藥典2010年版起,在中國藥典和國家藥品質量標準中,已有12個抗生素品種收載了系統適用性對照品(表2)?

β-內酰胺類抗生素因其穩(wěn)定性較差,制備混合雜質對照品時主要關注其降解雜質,標準色譜圖中需要對重點關注的已知雜質如聚合物雜質等進行定位?由于β-內酰胺類抗生素實際產品中聚合物類雜質采用相對保留時間定位較困難[15],采用原位降解的方法制備該雜質一般需摸索特殊的條件,且常需要放置較長的時間?在制備混合雜質對照品時,通常選擇樣品宜發(fā)生聚合反應的條件,如阿莫西林(圖3a)?氨芐西林品種混合雜質對照品(圖3b),色譜條件見表3~4,其中的主要聚合物(二聚體?三聚體)色譜峰明顯且易被識別,用該混合雜質對照品進行聚合物的定位,增加了檢驗方法的實用性[8]?

大環(huán)內酯類抗生素多為發(fā)酵和半合成來源的品種,雜質譜復雜?制備混合雜質對照品時主要關注發(fā)酵過程中產生的工藝雜質?副產物和降解雜質?

如阿奇霉素混合雜質對照品,通過在粗品原料中添加部分專門合成的特定雜質而制成(圖4a);紅霉素混合雜質對照品為特定菌株發(fā)酵產生的紅霉素粗品(圖4b)?上述混合雜質對照品在質量標準中用于系統適用性試驗,色譜條件見表5~6,通過控制難分離色譜峰的分離度,不僅可有效地表征色譜系統的有效性,且可以方便地對特定雜質進行定位[16]?

從保證藥品的安全性和藥品注冊的角度，雜質譜研究仍然是當前藥品質量研究的重點。目前我們已經基本確定了通過雜質對照品的研制促進藥品質量標準提高的策略。但伴隨著對雜質譜的全面、深入研究，諸雜質的毒性特性等將更加清晰、明確，是簡單地將所有發(fā)現的雜質全部列入質量標準，還是根據各個雜質的特性，針對性地選擇毒性較強、能夠代表工藝或產品穩(wěn)定性的指針性雜質納入標準，是雜質譜控制面臨的挑戰(zhàn)。從提高質量標準的有效性，提高質控效率，降低檢驗成本的角度，后者更具有優(yōu)勢。因而，雜質對照品的研制不僅是單純的制備、標定工作，而需要融入藥品質量控制的全過程。

在藥品質量標準中通過對特定雜質的控制保證產品的安全、有效是產品質量控制的發(fā)展方向。利用特定雜質對照品和混合雜質對照品雖然可以解決色譜分析中部分雜質定位、定量方面的問題，但對于性質不穩(wěn)定或不易獲得的雜質，一味強調利用實物對照品也會給藥品生產企業(yè)帶來巨大的壓力。中國藥典2020年版已在四部通則0512高效液相色譜法中增訂了利用光譜相似度定性和利用質譜檢測器定性的一般要求[17]；鑒于此，開展和推進雜質對照品的數字化研究，即將雜質的相關定性和定量信息，如色譜行為、UV、MS、校正因子等形成數據庫[18]，用于藥品的雜質研究和檢測中，是提高藥品質量研究效率和科學性的有效途徑。